20.109(S09):Module 1

M o d u l e 1

' ' ' I n s t r u c t o r s : ' ' '   [ h t t p : / / w e b . m i t . e d u / b e / p e o p l e / j a s a n o f f . h t m   A l a n   J a s a n o f f ]   a n d   [ [ U s e r : A g i S t a c h o w i a k |   A g i   S t a c h o w i a k ] ] 

' ' ' T A : ' ' '   [ [ Naiyan Chen ] ] 

I n t h i s e x p e r i m e n t , y o u w i l l modify a p r o t e i n c a l l e d i n v e r s e p e r i c a m ( d e v e l o p e d b y Nagai et al. in order to affect its functions as a sensor. I n v e r s e p e r i c a m ( I P C ) c o m p r i s e s a p e r m u t e d f l u o r e s c e n t p r o t e i n l i n k e d t o a c a l c i u m s e n s o r . T h e “i n v e r s e” i n t h e n a m e r e f e r s t o t h e f a c t t h a t t h i s p r o t e i n s h i n e s b r i g h t l y i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m , b u t d i m l y o n c e c a l c i u m i s a d d e d . T h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t < m a t h > K _ D < / m a t h > o f w i l d - t y p e I P C w i t h r e s p e c t t o c a l c i u m i s r e p o r t e d t o b e 0 . 2 μM ( s e e a l s o f i g u r e b e l o w ) . Y o u r g o a l w i l l b e t o s h i f t t h i s t i t r a t i o n c u r v e or change its steepness b y a l t e r i n g one of t h e c a l c i u m b i n d ing sites in I P C’s c a l c i u m s e n s o r p o r t i o n . Y o u w i l l m o d i f y i n v e r s e p e r i c a m a t t h e g e n e l e v e l u s i n g a p r o c e s s c a l l e d s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s , e x p r e s s t h e r e s u l t a n t p r o t e i n i n a b a c t e r i a l h o s t , a n d f i n a l l y p u r i f y y o u r m u t a n t p r o t e i n a n d a s s a y i t s c a l c i u m - b i n d i n g a c t i v i t y v i a f l u o r e s c e n c e . I n t h e c o u r s e o f t h i s m o d u l e , w e w i l l c o n s i d e r t h e b e n e f i t s a n d d r a w b a c k s o f d i f f e r e n t a p p r o a c h e s t o p r o t e i n d e s i g n , a n d t h e t y p e s o f s c i e n t i f i c i n v e s t i g a t i o n s a n d a p p l i c a t i o n s e n a b l e d b y f l u o r e s c e n t l y t a g g e d b i o l o g i c a l m o l e c u l e s .