20.109(S09):Module 1

{ { T e m p l a t e : 2 0 . 1 0 9 ( S 0 9 ) } } 

< d i v   s t y l e = " p a d d i n g :   1 0 p x ;   w i d t h :   6 4 0 p x ;   b o r d e r :   5 p x   s o l i d   # 996600 ; " > 

= = M o d u l e   1 = = 

' ' ' I n s t r u c t o r s : ' ' '   [ h t t p : / / w e b . m i t . e d u / b e / p e o p l e / j a s a n o f f . h t m   A l a n   J a s a n o f f ]   a n d   [ [ U s e r : A g i S t a c h o w i a k |   A g i   S t a c h o w i a k ] ] 

' ' ' T A : ' ' '   [ [ Naiyan Chen ] ] 

I n   t h i s   e x p e r i m e n t ,   y o u   w i l l  modify  a   p r o t e i n  c a l l e d   i n v e r s e   p e r i c a m   ( d e v e l o p e d   b y  Nagai et al.  in order to affect its functions as a sensor.   I n v e r s e   p e r i c a m   ( I P C )   c o m p r i s e s   a   p e r m u t e d   f l u o r e s c e n t   p r o t e i n   l i n k e d   t o   a   c a l c i u m   s e n s o r .   T h e   “i n v e r s e”     i n   t h e   n a m e   r e f e r s   t o   t h e   f a c t   t h a t   t h i s   p r o t e i n   s h i n e s   b r i g h t l y   i n   t h e   a b s e n c e   o f   c a l c i u m ,   b u t   d i m l y   o n c e   c a l c i u m   i s   a d d e d .   T h e   d i s s o c i a t i o n   c o n s t a n t   < m a t h > K _ D < / m a t h >   o f   w i l d - t y p e   I P C   w i t h   r e s p e c t   t o   c a l c i u m   i s   r e p o r t e d   t o   b e   0 . 2   μM   ( s e e   a l s o   f i g u r e   b e l o w ) .   Y o u r   g o a l   w i l l   b e   t o   s h i f t  t h i s   t i t r a t i o n   c u r v e  or change its steepness  b y   a l t e r i n g   one of t h e   c a l c i u m   b i n d ing sites  in   I P C’s   c a l c i u m   s e n s o r   p o r t i o n .   Y o u   w i l l   m o d i f y   i n v e r s e   p e r i c a m   a t   t h e   g e n e   l e v e l   u s i n g   a   p r o c e s s   c a l l e d   s i t e - d i r e c t e d   m u t a g e n e s i s ,   e x p r e s s   t h e   r e s u l t a n t   p r o t e i n   i n   a   b a c t e r i a l   h o s t ,   a n d   f i n a l l y   p u r i f y   y o u r   m u t a n t   p r o t e i n   a n d   a s s a y   i t s   c a l c i u m - b i n d i n g   a c t i v i t y   v i a   f l u o r e s c e n c e .   I n   t h e   c o u r s e   o f   t h i s   m o d u l e ,   w e   w i l l   c o n s i d e r   t h e   b e n e f i t s   a n d   d r a w b a c k s   o f   d i f f e r e n t   a p p r o a c h e s   t o   p r o t e i n   d e s i g n ,   a n d   t h e   t y p e s   o f   s c i e n t i f i c   i n v e s t i g a t i o n s   a n d   a p p l i c a t i o n s   e n a b l e d   b y   f l u o r e s c e n t l y   t a g g e d   b i o l o g i c a l   m o l e c u l e s . 

W e   g r a t e f u l l y   a c k n o w l e d g e   2 0 . 1 0 9   i n s t r u c t o r   N a t a l i e   K u l d e l l   f o r   h e l p f u l   d i s c u s s i o n s   d u r i n g   t h e   d e v e l o p m e n t   o f   t h i s   m o d u l e ,   a s   w e l l   a s   f o r   h e r   prior w o r k   i n   d e v e l o p i n g   a   [ h t t p : / / o p e n w e t w a r e . o r g / w i k i / 2 0 . 1 0 9 : M o d u l e _ 2   r e l a t e d   m o d u l e ] . 

[ [ I m a g e : 2 0 . 1 0 9   C a - I P C - T i t r - F i g . p n g | t h u m b | c e n t e r | 4 8 0 p x | ' ' ' T i t r a t i o n   c u r v e   f o r   I P C . ' ' '   S h o w n   h e r e   i s   s a m p l e   d a t a   f r o m   t h e   t e a c h i n g   l a b :   n o r m a l i z e d   f l u o r e s c e n c e   f o r   w i l d - t y p e   i n v e r s e   p e r i c a m   a s   a   f u n c t i o n   o f   c a l c i u m   c o n c e n t r a t i o n .   A s   y o u   w i l l   l a t e r   l e a r n ,   a n   a p p a r e n t   < m a t h > K _ D < / m a t h >   c a n   b e   e s t i m a t e d   f r o m   s u c h   a   p l o t :   i t   i s   t h e   p o i n t   o n   t h e   ' ' x ' ' - a x i s   w h e r e   t h e   c u r v e   c r o s s e s   ' ' y ' '   =   5 0 % ,   o r   ~ 0 . 1   & m u ; M   h e r e . ] ]   

[ [ 2 0 . 1 0 9 ( S 0 9 ) : S t a r t - u p   p r o t e i n   e n g i n e e r i n g   ( D a y 1 ) |   M o d u l e   2   D a y   1 :   S t a r t - u p   p r o t e i n   e n g i n e e r i n g ] ] < b r >