Difference between revisions of "20.109(S09):Module 1"

From Course Wiki
Jump to: navigation, search
(New page: { { T e m p l a t e : 2 0 . 1 0 9 ( S 0 9 ) } } < d i v s t y l e = " p a d d i n g : 1 0 p x ; w i d t h : 6 4 0 p x ; b o r d e r : 5 p x s o l i d # 996600 ; " > ...)
 
Line 1: Line 1:
−
{ { T e m p l a t e : 2 0 . 1 0 9 ( S 0 9 ) } }  
+
{{Template:20.109(S09)}}
−
+
 
−
< d i v  s t y l e = " p a d d i n g :   1 0 p x ;   w i d t h :   6 4 0 p x ;   b o r d e r :   5 p x  s o l i d  # 996600 ; " >  
+
<div style="padding: 10px; width: 640px; border: 5px solid #996600;">
−
+
 
−
= = M o d u l e  1 = =  
+
==M o d u l e  1==
 
   
 
   
 
  ' ' ' I n s t r u c t o r s : ' ' '  [ h t t p : / / w e b . m i t . e d u / b e / p e o p l e / j a s a n o f f . h t m  A l a n  J a s a n o f f ]  a n d  [ [ U s e r : A g i S t a c h o w i a k |  A g i  S t a c h o w i a k ] ]  
 
  ' ' ' I n s t r u c t o r s : ' ' '  [ h t t p : / / w e b . m i t . e d u / b e / p e o p l e / j a s a n o f f . h t m  A l a n  J a s a n o f f ]  a n d  [ [ U s e r : A g i S t a c h o w i a k |  A g i  S t a c h o w i a k ] ]  
Line 9: Line 9:
 
  ' ' ' T A : ' ' '  [ [ Naiyan Chen ] ]  
 
  ' ' ' T A : ' ' '  [ [ Naiyan Chen ] ]  
 
   
 
   
−
  I n  t h i s  e x p e r i m e n t ,  y o u  w i l l  modify  a  p r o t e i n  c a l l e d  i n v e r s e  p e r i c a m  ( d e v e l o p e d  b y  [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11248055 Nagai et al.]  in order to affect its functions as a sensor.  I n v e r s e  p e r i c a m  ( I P C )  c o m p r i s e s  a  p e r m u t e d  f l u o r e s c e n t  p r o t e i n  l i n k e d  t o  a  c a l c i u m  s e n s o r .  T h e  “i n v e r s e”    i n  t h e  n a m e  r e f e r s  t o  t h e  f a c t  t h a t  t h i s  p r o t e i n  s h i n e s  b r i g h t l y  i n  t h e  a b s e n c e  o f  c a l c i u m ,  b u t  d i m l y  o n c e  c a l c i u m  i s  a d d e d .  T h e  d i s s o c i a t i o n  c o n s t a n t  < m a t h > K _ D < / m a t h >  o f  w i l d - t y p e  I P C  w i t h  r e s p e c t  t o  c a l c i u m  i s  r e p o r t e d  t o  b e  0 . 2  &mu;M  ( s e e  a l s o  f i g u r e  b e l o w ) .  Y o u r  g o a l  w i l l  b e  t o  s h i f t  t h i s  t i t r a t i o n  c u r v e  or change its steepness  b y  a l t e r i n g  one of t h e  c a l c i u m  b i n d ing sites  in  I P C’s  c a l c i u m  s e n s o r  p o r t i o n .  Y o u  w i l l  m o d i f y  i n v e r s e  p e r i c a m  a t  t h e  g e n e  l e v e l  u s i n g  a  p r o c e s s  c a l l e d  s i t e - d i r e c t e d  m u t a g e n e s i s ,  e x p r e s s  t h e  r e s u l t a n t  p r o t e i n  i n  a  b a c t e r i a l  h o s t ,  a n d  f i n a l l y  p u r i f y  y o u r  m u t a n t  p r o t e i n  a n d  a s s a y  i t s  c a l c i u m - b i n d i n g  a c t i v i t y  v i a  f l u o r e s c e n c e .  I n  t h e  c o u r s e  o f  t h i s  m o d u l e ,  w e  w i l l  c o n s i d e r  t h e  b e n e f i t s  a n d  d r a w b a c k s  o f  d i f f e r e n t  a p p r o a c h e s  t o  p r o t e i n  d e s i g n ,  a n d  t h e  t y p e s  o f  s c i e n t i f i c  i n v e s t i g a t i o n s  a n d  a p p l i c a t i o n s  e n a b l e d  b y  f l u o r e s c e n t l y  t a g g e d  b i o l o g i c a l  m o l e c u l e s .  
+
  I n  t h i s  e x p e r i m e n t ,  y o u  w i l l  modify  a  p r o t e i n  c a l l e d  i n v e r s e  p e r i c a m  ( d e v e l o p e d  b y  [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11248055 Nagai et al.]  in order to affect its functions as a sensor.  I n v e r s e  p e r i c a m  ( I P C )  c o m p r i s e s  a  p e r m u t e d  f l u o r e s c e n t  p r o t e i n  l i n k e d  t o  a  c a l c i u m  s e n s o r .  T h e  “i n v e r s e”    i n  t h e  n a m e  r e f e r s  t o  t h e  f a c t  t h a t  t h i s  p r o t e i n  s h i n e s  b r i g h t l y  i n  t h e  a b s e n c e  o f  c a l c i u m ,  b u t  d i m l y  o n c e  c a l c i u m  i s  a d d e d .  T h e  d i s s o c i a t i o n  c o n s t a n t  < m a t h > K _ D < / m a t h >  o f  w i l d - t y p e  I P C  w i t h  r e s p e c t  t o  c a l c i u m  i s  r e p o r t e d  t o  b e  0 . 2  &mu;M  ( s e e  a l s o  f i g u r e  b e l o w ) .  Y o u r  g o a l  w i l l  b e  t o  s h i f t  t h i s  t i t r a t i o n  c u r v e  or change its steepness  b y  a l t e r i n g  one of t h e  c a l c i u m  b i n d ing sites  in  I P C’s  c a l c i u m  s e n s o r  p o r t i o n .  Y o u  w i l l  m o d i f y  i n v e r s e  p e r i c a m  a t  t h e  g e n e  l e v e l  u s i n g  a  p r o c e s s  c a l l e d  s i t e - d i r e c t e d  m u t a g e n e s i s ,  e x p r e s s  t h e  r e s u l t a n t  p r o t e i n  i n  a  b a c t e r i a l  h o s t ,  a n d  f i n a l l y  p u r i f y  y o u r  m u t a n t  p r o t e i n  a n d  a s s a y  i t s  c a l c i u m - b i n d i n g  a c t i v i t y  v i a  f l u o r e s c e n c e .  I n  t h e  c o u r s e  o f  t h i s  m o d u l e ,  w e  w i l l  c o n s i d e r  t h e  b e n e f i t s  a n d  d r a w b a c k s  o f  d i f f e r e n t  a p p r o a c h e s  t o  p r o t e i n  d e s i g n ,  a n d  t h e  t y p e s  o f  s c i e n t i f i c  i n v e s t i g a t i o n s  a n d  a p p l i c a t i o n s  e n a b l e d  b y  f l u o r e s c e n t l y  t a g g e d  b i o l o g i c a l  m o l e c u l e s .
−
+
−
W e  g r a t e f u l l y  a c k n o w l e d g e  2 0 . 1 0 9  i n s t r u c t o r  N a t a l i e  K u l d e l l  f o r  h e l p f u l  d i s c u s s i o n s  d u r i n g  t h e  d e v e l o p m e n t  o f  t h i s  m o d u l e ,  a s  w e l l  a s  f o r  h e r  prior w o r k  i n  d e v e l o p i n g  a  [ h t t p : / / o p e n w e t w a r e . o r g / w i k i / 2 0 . 1 0 9 : M o d u l e _ 2  r e l a t e d  m o d u l e ] .
+
−
+
−
[ [ I m a g e : 2 0 . 1 0 9  C a - I P C - T i t r - F i g . p n g | t h u m b | c e n t e r | 4 8 0 p x | ' ' ' T i t r a t i o n  c u r v e  f o r  I P C . ' ' '  S h o w n  h e r e  i s  s a m p l e  d a t a  f r o m  t h e  t e a c h i n g  l a b :  n o r m a l i z e d  f l u o r e s c e n c e  f o r  w i l d - t y p e  i n v e r s e  p e r i c a m  a s  a  f u n c t i o n  o f  c a l c i u m  c o n c e n t r a t i o n .  A s  y o u  w i l l  l a t e r  l e a r n ,  a n  a p p a r e n t  < m a t h > K _ D < / m a t h >  c a n  b e  e s t i m a t e d  f r o m  s u c h  a  p l o t :  i t  i s  t h e  p o i n t  o n  t h e  ' ' x ' ' - a x i s  w h e r e  t h e  c u r v e  c r o s s e s  ' ' y ' '  =  5 0 % ,  o r  ~ 0 . 1  & m u ; M  h e r e . ] ] 
+
−
+
−
[ [ 2 0 . 1 0 9 ( S 0 9 ) : S t a r t - u p  p r o t e i n  e n g i n e e r i n g  ( D a y 1 ) |  M o d u l e  2  D a y  1 :  S t a r t - u p  p r o t e i n  e n g i n e e r i n g ] ] < b r >
+

Revision as of 17:46, 30 September 2008


20.109(S09): Laboratory Fundamentals of Biological Engineering

20.109(S09) frontpg.JPG

Home        People        Schedule Spring 2009        | Assignments        Lab Basics        | OWW Basics       
Protein Engineering        Expression Engineering        Cell-Biomaterial Engineering              

M o d u l e 1

' ' ' I n s t r u c t o r s : ' ' '   [ h t t p : / / w e b . m i t . e d u / b e / p e o p l e / j a s a n o f f . h t m   A l a n   J a s a n o f f ]   a n d   [ [ U s e r : A g i S t a c h o w i a k |   A g i   S t a c h o w i a k ] ] 

' ' ' T A : ' ' '   [ [ Naiyan Chen ] ]
I n t h i s e x p e r i m e n t , y o u w i l l modify a p r o t e i n c a l l e d i n v e r s e p e r i c a m ( d e v e l o p e d b y Nagai et al. in order to affect its functions as a sensor. I n v e r s e p e r i c a m ( I P C ) c o m p r i s e s a p e r m u t e d f l u o r e s c e n t p r o t e i n l i n k e d t o a c a l c i u m s e n s o r . T h e “i n v e r s e” i n t h e n a m e r e f e r s t o t h e f a c t t h a t t h i s p r o t e i n s h i n e s b r i g h t l y i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m , b u t d i m l y o n c e c a l c i u m i s a d d e d . T h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t < m a t h > K _ D < / m a t h > o f w i l d - t y p e I P C w i t h r e s p e c t t o c a l c i u m i s r e p o r t e d t o b e 0 . 2 μM ( s e e a l s o f i g u r e b e l o w ) . Y o u r g o a l w i l l b e t o s h i f t t h i s t i t r a t i o n c u r v e or change its steepness b y a l t e r i n g one of t h e c a l c i u m b i n d ing sites in I P C’s c a l c i u m s e n s o r p o r t i o n . Y o u w i l l m o d i f y i n v e r s e p e r i c a m a t t h e g e n e l e v e l u s i n g a p r o c e s s c a l l e d s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s , e x p r e s s t h e r e s u l t a n t p r o t e i n i n a b a c t e r i a l h o s t , a n d f i n a l l y p u r i f y y o u r m u t a n t p r o t e i n a n d a s s a y i t s c a l c i u m - b i n d i n g a c t i v i t y v i a f l u o r e s c e n c e . I n t h e c o u r s e o f t h i s m o d u l e , w e w i l l c o n s i d e r t h e b e n e f i t s a n d d r a w b a c k s o f d i f f e r e n t a p p r o a c h e s t o p r o t e i n d e s i g n , a n d t h e t y p e s o f s c i e n t i f i c i n v e s t i g a t i o n s a n d a p p l i c a t i o n s e n a b l e d b y f l u o r e s c e n t l y t a g g e d b i o l o g i c a l m o l e c u l e s .
Retrieved from "http://engineerbiology.org/w/index.php?title=20.109(S09):Module_1&oldid=18940"